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    DB51 T 613-2006 柑桔黃龍病檢驗鑒定技術規程

  • 上傳人: lu****yz
  • 文檔編號:31978
  • 上傳時間:2016-07-29
  • 文檔格式:PDF
  • 文檔頁數:10
  • 文檔大?。?88.46KB
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    DB51 613 2006 柑桔 黃龍 檢驗 鑒定 技術規程
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    1、 案號: 6132006柑桔黃龍病檢驗鑒定技術規程 006布 2006施四川省質量技術監督局發布203 6132006 I 目 次 1 范圍 . 205 2 規范性引用文件 . . 205 3 術語和定義 . . 205 4 原理 . 205 5 田間調查 . . 205 6 樣品采集 . . 205 7 柑桔黃龍病菌分子鑒定(. 206 8 結果判定 . . 208 9 檢測后樣品的處理 . 208 附錄 A (資料性附錄) 柑桔黃龍病癥狀特征 . 209 附錄 B (資料性附錄) 柑桔木虱形態特征 . 210 6132006 204 前 言 本標準的附錄本標準由四川省農業廳提出并歸口。 本。

    2、標準由四川省農業廳植物檢疫站負責起草,重慶大學參加起草。 本標準主要起草人:趙蘭鸰、寧紅、王中康、陳素清、李剛、帥波、夏雨先、袁青。 6132006 205柑桔黃龍病檢驗鑒定技術規程 1 范圍 本標準規定了柑桔黃龍病的田間癥狀調查、實驗室分子檢驗技術要求。 本標準適用于對蕓香科植物感染柑桔黃龍病植株以及柑桔黃龍病菌傳播媒介的檢驗、檢測和鑒定。 2 規范性引用文件 下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件,其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內容)或修訂版均不適用于本標準,然而,鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最。

    3、新版本適用于本標準。 040柑桔苗木產地檢疫規程 447柑桔潰瘍病檢驗鑒定標準 3 術語和定義 下列術語和定義適用于本標準 桔黃龍病 由 起、主要由柑桔木虱 播的一種危害柑桔屬、金柑屬和枳屬植物葉片、枝條和果實的檢疫性病害。 4 原理 柑桔黃龍病的田間癥狀復雜多樣,該病菌屬難培養菌,目前尚無法進行人工培養,因此,在鑒定時除了進行田間識別外,主要采取病原菌增的方式進行檢測。用根據柑桔黃龍病菌核糖體基因序列設計的一對特異性引物與模板待檢樣品中病原菌行聚合酶鏈式反應(引物與模板使樣品所帶的微量柑桔黃龍病菌終通過凝膠電泳分離檢測出382根據該譜帶的有無確定樣品是否帶有柑桔黃龍病菌。 5 田間調查 狀調。

    4、查 用目測方法檢查葉片、果實、枝條,癥狀特征參見附錄 A。發現疑似癥狀樣本送實驗室檢驗。 桔木虱調查 4月9月檢查柑桔植株的新芽、嫩梢上有無柑桔木虱,柑桔木虱形態特征參見附錄B。發現柑桔木虱將其送實驗室檢測是否帶柑桔黃龍病菌。 6 樣品采集 桔葉片采集 定取樣 6132006 206 采有典型和疑似癥狀的嫩梢葉片,樣品裝入牛皮紙袋中, 5天內送實驗室檢驗, 取樣數量按照 447測取樣 采取五點取樣法,采摘嫩梢葉片,每株分東南西北四個方位采集,樣品裝入牛皮紙袋中,5天內送實驗室檢驗,取樣數量按照 447桔木虱采集 用捕蟲網在柑桔園內柑桔植株嫩梢上捕捉柑桔木虱,將木虱放入95酒精中密閉保存,送實驗。

    5、室檢驗。 7 柑桔黃龍病菌分子鑒定(劑 除非另有說明,本標準所用試劑均為分析純,所有試劑均用高壓滅菌的無菌容器分裝。 菌超純水 O 沖液10 異性引物對50M 5 55/L NA 00 100異丙醇溶液 1M 劑,加水攪拌溶解,配好后高壓滅菌。 1M 稱取 37 劑,在磁力攪拌器上劇烈攪拌,邊攪拌邊加入 N 至 熱溶解, 直到溶液澄清,高壓滅菌。 10% 稱取20末,加熱到 68助溶。 取液 取T 10 4010 加熱攪拌至 70混合均勻, 調 壓滅菌,室溫保存。 白酶 K 液10 g/L 稱取 5白酶 K, 加入 500 L 無菌超純水水混合均勻,存。 硫氰酸胍液4M 硫氰酸胍溶于 20 ,。

    6、62加熱助溶,4保存。 泳緩沖液 1L 水中加入 42g,冰醋酸 H 2O,置成 50 倍貯存液;使用時稀釋為 1 倍工作液。 脂糖凝膠2% 在%瓊脂糖,融化后在每 100脂糖中加入 5V),冷卻至 60倒入相應制膠槽中,插入梳子,冷卻凝固。 器和用品用具 水平電泳儀 高速臺式離心機,離心力可達10 000凝膠成像系統 微量移液器一套:0L,5L20L,20L200L,200L1000L 樣制備 品存放 6132006 207采集的樣品在28條件下保存應不超過一周,若需長期保存,應置于下,凍融不超過3次。 品預處理 片 隨機的選取柑桔葉片,流水清洗干凈,吸水紙擦干,于培養皿內用無菌剪刀將材料剪。

    7、碎,桔木虱 將采集的柑桔木虱1頭5頭,研磨棒將其磨碎。 品 取 在裝有樣品的離心管中加入800 合均勻后置于65水浴1h。 吸取上清液轉入新的1.5 入 上清液1/2體積的異硫氰酸胍液,混合均勻,室溫下放置10 0 000吸取上清液加入微濾柱中,10 000濾液。 向微濾柱中加入100異丙醇500 L,10 000濾液。 重復上一步驟,至濾液無植物色素。 空微濾柱10 000向微濾柱中加入50 0 000集濾液,即為樣品模板測 測體系 柑桔黃龍病 測體系見表 1,體系總體積 25L/管。 表 1 柑桔黃龍病 測體系 檢測試劑 終濃度 每管加入量 L 沖液 1 物對 .3 1U/25L 1 板0。

    8、5025L 2 總體積 25 應 依次將物對、入42 入循環,9220s,5630s,7245s,30個循環;727 下保存。 檢測時同時設陰性對照和陽性對照。 泳及成像 泳 將物8L 與樣品緩沖液混合,加入瓊脂糖凝膠的點樣孔中,同時設00 伏電壓電泳約半小時。 6132006 208 像及分析 將電泳后的瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統觀察窗內,觀察分析并成像保存。 8 結果判定 田間癥狀作為一種輔助診斷手段。樣品增產物經凝膠成像系統觀察,凝膠上陽性對照出現一條382性對照沒有該特異性條帶;供試樣品出現與陽性對照相同大小的382品為陽性,即帶柑桔黃龍病菌;供試樣品未出現與陽性對照相同大小的382品。

    9、為陰性,即不帶柑桔黃龍病菌。 9 檢測后樣品的處理 用于柑桔黃龍病檢測的樣品、用具在完成檢驗后,用具應進行滅活處理,樣品集中銷毀。 6132006 209附 錄 A (資料性附錄) 柑桔黃龍病癥狀特征 A 癥狀特征 柑桔黃龍病不同時期不同部位的典型癥狀如下: 春梢 病樹上當年抽生的春梢葉片轉綠后,自5月開始其新梢成熟葉片一般沿主側脈附近、葉片基部及邊緣褪綠黃化,形成黃綠相間的斑駁癥狀。特點:春梢葉片轉綠后才褪綠變黃;葉片黃化程度較輕且不均勻,形成斑駁;發病的新梢較多,在樹冠的上、中、下部 均有出現;春梢病狀發展較快,在4般到冬季便可全株發病。 夏秋梢 5梢一般出現在樹冠頂部,多數1病的夏秋梢在。

    10、葉片老熟過程中往往葉脈先變黃,隨后葉肉由淡黃綠變成黃色,均勻黃化,形成黃梢。 病梢中后期癥狀 當年感病的黃梢一般在秋末先后落葉成禿枝,翌年春季禿枝重新萌發新芽,且時間早萌芽多,所形成的新梢短而纖弱,葉片窄小,葉片老熟時,葉肉停止轉綠變黃,但葉脈和其附近組織仍綠色,癥狀與缺鋅、缺錳相似,形成花葉。 果實癥狀 感病中期病樹所結果實,一般外形變小、畸形,堅硬,著色不均勻,果頂青色;果肉汁少、味酸、渣多,風味極差;種子變褐,發育不健全。 6132006 210 附 錄 B (資料性附錄) 柑桔木虱形態特征 類地位 柑桔木虱 態特征 成蟲 卵近橢圓形,上端尖細,下端鈍圓,形似杧果 。有一短柄、桔黃色,生或不規則聚生。 蟲 身青灰色,有刻點,上有白蠟粉,頭部灰褐色,頭部前方的兩個頰錐凸出明顯。觸角10節,灰黃色,端部2節黑色,末端具2根長短不一的硬毛。前胸略隆起。前翅半透明,散布褐色斑紋,前緣色深形成褐色帶,近外緣的邊上有5個半圓形透明斑。脈序“介”字形分枝,缺翅痣。后翅稍短無色透明。足黃色或黃褐色。腹背黑褐色,腹面淡綠色。雌蟲產卵期呈桔紅色。腹部紡錘形,末端尖。 蟲 若蟲扁橢圓形,背面隆起。共5齡,1齡黃色,復眼紅色,自3齡起各齡后期體色變為黃、褐相間的顏色。二齡始顯露翅芽。各齡若蟲腹部周緣分泌有白色蠟絲,自頭部至腹部第4節背中線為黃白色或黃綠色。 。

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